Tạo β - glucosidase siêu chịu nhiệt tái tổ hợp từ cổ khuẩn Pyrococcus furiosus trong Escherichia coli để sản xuất isoflavone từ đậu nành
Lam Vân
15/06/2019
KH&CN trong nước
Đề tài do tác giả Đinh Nguyễn Tấn Hòa và cộng sự (Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ) thực hiện nhằm tạo dòng thành công tế bào E. coli sản xuất enzyme β -glucosidase (BGL) từ cổ khuẩn Pyrococcus furiosus dạng tan và có hoạt tính; xác định điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu cho hoạt tính của enzyme; thử nghiệm hoạt tính enzyme trên hợp chất isoflavone glucoside từ đậu nành.
Đậu nành là một trong những đối tượng nghiên cứu phổ biến nhất vì chứa hàm lượng isoflavone cao, có tác dụng chống oxi hóa, giúp làm đẹp, phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh. Tuy nhiên, isoflavone tồn tại trong thực vật chủ yếu ở dạng hợp chất glycoside nên bị bất hoạt. Muốn thu nhận được dạng có hoạt tính cần tiến hành loại bỏ gốc đường để giải phóng dạng alygone tương ứng.
BGL là enzyme có khả năng phân cắt glucose từ đầu không khử, nhờ đó giải phóng được các hợp chất isoflavone ở dạng có hoạt tính. Biết được điều này, con người đã bổ sung các chủng vi khuẩn có khả năng tạo BGL trong quy trình sản xuất. Tuy nhiên gặp phải nhiều vấn đề như: thời gian lên men lâu dễ gây tạp nhiễm và làm giảm chất lượng thực phẩm; enzyme thu nhận từ các nguồn vi sinh hiện nay thường không chịu được nhiệt độ cao gây nhớt và dễ bị ức chế bởi các thành phần có trong nguyên liệu, đặc biệt là glucose nên chưa được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp.
Trong đề tài này, nhóm tác giả nghiên cứu thu nhận enzyme BGL từ cổ khuẩn Pyrococcus furiosus với khả năng chịu nhiệt cao, chịu được nồng độ glucose cao, kháng protease phù hợp với quy trình chế biến và tách chiết phổ thông, mang tiềm năng ứng dụng trong cả nghiên cứu và sản xuất.
Theo đó, đề tài đã tạo dòng và biểu hiện thành công enzyme BGL siêu chịu nhiệt tái tổ hợp từ cổ khuẩn Pyrococcus furiosus trong E. coli và bước đầu thử nghiệm hoạt tính thành công trên cơ chất đậu nành. Cụ thể, tạo dòng thành công tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pGEX/2TK-celB; tạo dòng thành công tế bào E. coli BL1 mang vector tái tổ hợp pGEX/2TK-celB biểu hiện enzyme BGL dạng tan, với hàm lượng chiếm 17,04%. Sau tinh chế đạt 57.5%.
Tối ưu hóa điều kiện cho hoạt tính trên cơ chất pNPG (p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside), 1000C tại pH 5.0, hoạt tính riêng của enzyme đạt 164.44 U/mg. Xây dựng phương trình động học enzyme, xác định các giá trị Vmax, Km và Kcat lần lượt là 332.27 U.mg-1.min-1, 0.088 mM, và 446.9 s-1. Bước đầu thử nghiệm hoạt tính trên cơ chất đậu nành cho thấy enzyme BGLPf (Pyrococcus furiosus β-glucosidase) có khả năng phân cắt các isoflavone glucoside như daidzin, genistin để giải phóng dạng aglycone tương ứng.