Tình hình sản xuất và tiêu thụ
Salmonella spp. thuộc họ Enterobacteriaceae, là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra nhiễm khuẩn trên thực phẩm. Trong đó, S. typhimurium và S. enteritidis là hai kiểu huyết thanh thường gặp gây bệnh phổ biến cho người. Ước tính có 75% trường hợp ở người mắc bệnh do Salmonella là do ăn phải những thức ăn bị nhiễm khuẩn bao gồm thịt bò, thịt heo, thịt gia cầm và trứng.
Hiện đã có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện vi khuẩn Salmonella. Phương pháp nuôi cấy truyền thống (ISO 65791: 2017) bao gồm giai đoạn tăng sinh và kiểm tra sinh hóa thường mất thời gian từ 5 đến 7 ngày để cho kết quả kiểm tra. Phương pháp phát hiện dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, real-time PCR,… cho kết quả kiểm tra nhanh và đặc hiệu hơn sau thời gian 2 ngày nhưng kỹ thuật này yêu cầu các thiết bị và hóa chất đắt tiền.
Kỹ thuật LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) là phương pháp nhân bản DNA có thể tổng hợp một đoạn DNA lớn mà không cần các chu trình biến nhiệt. Kỹ thuật này sử dụng 4 mồi khác nhau được thiết kế đặc biệt để nhận ra 6 vùng riêng biệt trên gen đích và phản ứng diễn ra ở một nhiệt độ duy nhất. Quá trình tái bản và phát hiện gen đích chỉ diễn ra trong một bước duy nhất. Trên thế giới, LAMP được ứng dụng để phát hiện virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh vật. Trong đó đã được ứng dụng để phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh cho người trong thực phẩm (đặc biệt trên nền mẫu thịt và rau).
LAMP có nhiều ưu điểm như: chính xác, đơn giản, giá thành thấp, thời gian thực hiện ngắn, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có thể sử dụng để phát hiện Salmonella ngay tại hiện trường. Phương pháp này phù hợp nhất cho hoạt động phát hiện ngoài phòng thí nghiệm cũng như các phòng thí nghiệm ít được trang bị hoặc các tổ chức thử nghiệm.
Quy trình và phương pháp thực hiện
Quy trình phân tích Salmonella trên nền mẫu thịt và rau bằng phương pháp LAMP
Thu mẫu:
Mẫu thực phẩm (thịt tươi, rau tươi) xét nghiệm phải được lấy trong điều kiện vô trùng, dụng cụ lấy và chứa mẫu phải được khử trùng trước, thao tác thực hiện tránh làm ô nhiễm chéo vi khuẩn từ bên ngoài vào mẫu. Trộn đều các phần trước khi lấy mẫu, lấy đủ lượng mẫu theo quy định.
Vận chuyển và bảo quản:
Việc vận chuyển mẫu vào phòng thí nghiệm và bảo quản phải đảm bảo mẫu thử được giữ trong điều kiện hạn chế đến mức thấp nhất sự thay đổi số lượng vi sinh vật trong mẫu thử: giữ ở nhiệt độ từ 1 – 8oC. Phân tích càng sớm càng tốt trong 24 giờ từ khi lấy mẫu, tối đa là sau 48 giờ.
Thực hiện quy trình:
A. Chuẩn bị mẫu (bước tăng sinh):
Bổ sung 225ml môi trường (150ml Buffered Peptone Water/BPW + 75ml Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth/RVS) vào 25g mẫu đã cân vô trùng. Ủ tăng sinh ở 37oC trong 12 ± 2 giờ.
B. Tách chiết DNA:
1. Chuẩn bị các eppendorf 1,5ml đánh số tương ứng với số mẫu. Bật bồn ủ nhiệt ở 95oC.
2. Cho vào mỗi eppendorf 1ml dịch tăng sinh. Đồng thời cho 1ml nước cất vào 1 eppendorf 1,5ml khác để làm ống chứng âm tách chiết.
3. Ly tâm các eppendorf 10.000 vòng/phút, trong 2 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.
4. Huyền phù sinh khối trong 200µl NaOH 50mM (nền mẫu rau) hoặc 200µl NaOH 100mM (nền mẫu thịt). Vortex để sinh khối được trộn đều dung dịch đệm.
5. Lưu ý: đây là bước rửa sinh khối tế bào. Cần vortex kỹ để trộn đều sinh khối, loại bỏ những chất ức chế phản ứng PCR.
6. Đặt ống vào bồn ủ nhiệt (hoặc tủ ủ 95oC) trong 5 phút.
7. Sau đó, siêu âm mẫu trong 30 giây.
8. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút ở nhiệt độ phòng.
9. Dùng pipette chuyển 300µl dịch nổi bên trên chứa DNA sang 1 eppendorf 1,5ml mới. Lưu ý: nên chuyển dịch nổi chứa DNA sang một ống mới, để DNA sạch, không lẫn tạp chất, nhất là trong trường hợp không thực hiện phản ứng PCR ngay.
10. Bảo quản DNA ở nhiệt độ 2 - 8oC trong 2 - 3 ngày. Trữ trong -20oC trong 3-6 tháng.
C. Thực hiện phản ứng LAMP:
Sử dụng 2µl DNA cho phản ứng LAMP. Thực hiện phản ứng LAMP trên eppendorf PCR 0,2ml với thể tích 25µl có thành phần như sau: 1X Isothermal Amplification Buffer II; 6mM MgSO4; 1,4mM dNTP; 0,8M betaine; 1,6µM các mồi FIP và BIP; 0,2µM mồi F3 và B3; 0,4µM LoopF/B Primers; 320U/ml Bst 3.0 DNA polymerase. Phản ứng được ủ ở nhiệt độ 63°C trong thời gian 60 phút. Dừng phản ứng bằng ủ ở 80°C trong 10 phút. Song song thực hiện 1 mẫu dương tính, 1 mẫu âm tính phản ứng LAMP thay DNA từ mẫu bằng nước cất. Hai phản ứng này được gọi là chứng dương PCR và chứng âm PCR.
Ngoài ra, nên chạy thêm 1 phản ứng chứng âm tách chiết để kiểm soát quá trình tách chiết không bị nhiễm trình tự mục tiêu.
Lưu ý: không được trộn ống MasterMix bằng máy vortex.
D. Phân tích kết quả:
Sự có mặt hay vắng mặt của DNA mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm LAMP thông qua việc quan sát sự thay đổi màu của HNB trên ống phản ứng.
Bảng so màu nhận biết mẫu âm tính hoặc dương tính với Salmonella.
F. Thông số kỹ thuật:
Toàn bộ thông số kỹ thuật của quy trình LAMP được xây dựng trên chủng Salmonella enteritidis ATCC 13076, theo quy trình ISO 16140:2003.
Giới hạn phát hiện của quy trình LAMP được xác định là số CFU vi khuẩn Salmonella spp. ban đầu nhiễm trên 25g mẫu thực phẩm (nền mẫu rau tươi và thịt tươi) kiểm nghiệm là 3 CFU/25g.
Độ đặc hiệu: độ chuyên biệt và đặc hiệu của quy trình LAMP được xây dựng dựa trên khảo sát 10 chủng Salmonella spp. và các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm khác (Listeria monocytogenes ATCC1911, E.coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 6538). Kết quả cho thấy quy trình chỉ phát hiện các chủng thuộc loài Salmonella spp. và không phát hiện các loài vi sinh vật không phải Salmonella spp.
Kết quả phân tích Salmonella trên nền mẫu thịt heo tươi và rau bằng phương pháp LAMP để xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp.
Ưu điểm của công nghệ, hiệu quả kinh tế
Phương pháp LAMP được xây dựng có độ đặc hiệu (SP) đạt 94%; độ chính xác (AC) đạt 94%; độ nhạy (SE) đạt 100%; tỷ lệ âm tính giả 0% và tỷ lệ dương tính giả 6%. Giới hạn phát hiện (LOD50) của phương pháp là 3 CFU/25g. Hiệu quả phân tích Salmonella trong thực phẩm bằng phương pháp LAMP tương đương với phương pháp real-time PCR (theo quy trình ISO 16140:2003) nhưng có thời gian phân tích ngắn hơn (chỉ sau 12 giờ).
Kết quả phân tích 50 mẫu gây nhiễm ở các nồng độ khác nhau để xác định LOD50 trên mẫu thịt heo tươi và rau bằng LAMP và real-time PCR.
Quy trình phân tích Salmonella trên nền mẫu thịt và rau bằng phương pháp LAMP đang được áp dụng tại phòng Phân tích Kiểm nghiệm Nông sản (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao) để phát triển dịch vụ phân tích “Phát hiện nhanh Salmonella spp. trên thực phẩm”, đạt các tiêu chí theo ISO 17025.
Quy trình có thể chuyển giao ứng dụng cho các đơn vị phân tích, nhất là với những vùng đang còn thiếu thốn về cơ sở hạ tầng cũng như yếu kém về khoa học công nghệ. Qua đó giúp tiết kiệm chi phí, mang lại hiệu quả kinh tế vì không yêu cầu nhiều thiết bị như máy luân nhiệt và chu trình nhiệt, giảm được thời gian vận chuyển, thời gian phát hiện nhanh.
Cụ thể, thời gian thực hiện các phương pháp như PCR, real-time trung bình khoảng 2,5 - 3 giờ, trong khi thời gian thực hiện LAMP trung bình chỉ khoảng 1 - 1,5 giờ. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc chẩn đoán và xác định vi khuẩn Salmonella khi nhiễm trên thực phẩm. Đây cũng là cơ sở kỹ thuật để triển khai áp dụng phương pháp LAMP đến các phòng thí nghiệm phân tích Salmonella nhiễm trên mẫu thịt heo tươi và rau tươi.
Hiện nhóm tác giả đang tiếp tục hợp tác với Sàn Giao dịch công nghệ Techport.vn (thuộc Trung tâm Thông tin và Thống kê Khoa học và Công nghệ – Sở KH&CN TP.HCM) để sẵn sàng chuyển giao quy trình cho các đơn vị, tổ chức có nhu cầu.
Thông tin chuyên gia, hỗ trợ
1. ThS. Nguyễn Phạm Trúc Phương
Điện thoại: 0913.882.944. Email: nptphuong1988@gmail.com
2. Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao
Địa chỉ: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP.HCM. Điện thoại: (028) 6886 2726
3. Trung tâm Thông tin và Thống kê Khoa học và Công nghệ - Phòng Giao dịch Công nghệ
Địa chỉ: 79 Trương Định, P. Bến Thành, Q.1, TP. HCM
Điện thoại: (028) 3822 1635 - Fax: (028) 3829 1957
Email: pgdcn@cesti.gov.vn
Lam Vân (CESTI)